학술용혈성요독증후군 유발 독소의 고감도 검출기술 개발 - 이엠디

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- 장출혈성대장균에서 분비되는 독소의 고감도 휴대용 검출기술 개발

- 향후 시가독소의 고감도검출을 위한 휴대용바이오센서 개발에 기여할 것으로 기대

용혈성요독증후군(HUS)질환을 유발하는 장출혈성대장균의 감염원과 핵심병인독성물질인 시가독소의 인체장기손상경로

순수 국내연구진이 용혈성요독증후군(Hemolytic Uremic Syndrome, HUS질환)을 유발하는, 장출혈성대장균에서 분비되는 핵심독소인 시가독소 고감도검출기술을 개발하였다. 향후 기존 검출 방식보다 신속․간편한 바이오센서 기술개발에 큰 기여를 할 것으로 기대된다.

* 시가독소 : 장출혈성대장균이 병원체외부로 뿜어내는 대장균독성단백질로서 인체에 강하게 부착하여 콩팥, 중추신경계 등 우리 몸의 중요장기의 기능에 장애를 직접적으로 유발하는 독소

* 용혈성요독증후군(Hemolytic Uremic Syndrome, HUS질환) : 여름철 자주 발생하는 제1군 법정 감염병인 장출혈성대장균감염증(출혈성 장염)의 합병증. 1982년 미국 패스트푸드점에서 장출혈성대장균감염증 환자 중 HUS가 처음 집단 발병했을 때 원인이 된 음식이 햄버거여서 '햄버거병'으로 알려졌지만, 이는 정확한 명칭이 아니며 소고기뿐만 아니라 돼지, 양, 닭, 다른 고기와 분변에 오염된 유제품, 채소도 감염원이 될 수 있음. HUS는 우리 몸의 혈류내 면역세포에 강하게 결합한 상태로 이동한 병원균의 독소 등에 의해 적혈구가 비정상적으로 파괴되면서 손상된 적혈구가 콩팥의 여과 시스템에 찌꺼기처럼 끼어 기능 손상을 초래하며, 미세혈관병증 용혈성 빈혈, 혈소판 감소증, 급성신부전, 중추신경계장애 등이 나타남.

한국생명공학연구원(원장 김장성, 이하 생명연) 환경질환연구센터 이무승 박사팀(교신저자: 이무승)과 국립한밭대학교 구치완교수팀(교신저자: 구치완)이 공동 수행한 이번 연구는 한국연구재단이 추진하는 교육부 이공분야기초연구사업과 농촌진흥청 농업과학기술개발사업의 지원으로 수행되었고, 생물학 분야의 저널인 플로스원(Plos One) 7월 16일자(한국시각 7월17일) 온라인 판에 게재되었다.

(논문명 : A portable and high-sensitivity optical sensing system for detecting fluorescently labeled enterohaemorrhagic Escherichia coli Shiga toxin 2B-subunit )

식중독대장균에 의한 감염성질환의 일종인 용혈성요독증후군(Hemolytic Uremic Syndrome, HUS)은 다진 고기를 제대로 익히지 않거나, 오염된 칼과 도마로 조리한 야채 등을 통해서도 걸릴 수 있다.

용혈성요독증후군은 시가독소를 생산하는 장출혈성대장균 감염증의 일종으로 노폐물을 배설하고 체내 항상성을 유지하는 기능을 하는 중요한 장기인 신장(콩팥)이 불순물을 제대로 걸러주지 못해 체내에 쌓이면서 발생하게 된다. 심할 경우 과염증성물질 체내생성(싸이토카인 폭풍)을 동반한 급성 신부전증이 나타나며 혼수․마비 증상까지 이어지기도 한다.

현재 시가독소를 검출하기 위해 가장 많이 쓰이고 있는 PCR 검출법이나 항원-항체 시험법은 숙련된 기술자나 오랜 전처리시간, 그리고 현장에서 고감도로 판별하는데 한계가 있어왔다. 따라서 신속·간편·정확한 시가독소 검출기술개발이 필요한 상황이었다.

이에 연구팀은 본 연구 개발을 통해, 형광 기반의 시가독소 검출법을 이용한 휴대형 고감도 광학 검출기기를 제작하였다.

(크기: 약 17×13×9 cm³, 무게: 약 770g)

개발된 휴대형 검출기기는 고정밀 측정기기의 도움없이, 자체 시스템만으로 형광분자 검출을 할 수 있으며 110 pM의 높은 민감도를 가지며, 이는 낮은 농도의 시가독소 단백질을 검출할 수 있게 하였다. 또한 마이크로컨트롤러를 이용하여 주변 컴퓨터나 기타 기기의 도움 없이 실시간으로 LCD디스플레이에 독소 검출 결과를 확인할 수 있다.

연구책임자인 이무승/구치완 박사는 “이번 연구성과는 우리 실생활 먹거리나 많은 농식품 재료에 오염될 수 있는 시가독소생산 대장균, 리스티리아, 살모넬라 등에 의한 감염체를 오류없이 검출하는 휴대형 검출기기 개발의 기반이 될 수 있을 것이다”며, “개발된 휴대형 광학검출기는 다른 종류의 바이오/의료 샘플 분석에도 사용될 수 있을 것이며, PCR 기기의 진단속도 및 정확도를 높이는 데에도 활용될 수 있을 것으로 예상한다.”고 밝혔다.

연구 결과 개요

□ 연구배경

· 식중독대장균에 의한 감염성질환의 일종인 용혈성요독증후군(Hemolytic Uremic Syndrome, 이하 HUS)은 다진고기를 제대로 익히지 않거나, 오염된 칼과 도마로 조리한 야채 등을 통해서도 걸릴 수 있다. HUS는 시가독소를 생산하는 장출혈성대장균(Shiga toxin-producing E.coli)감염증의 일종으로 노폐물을 배설하고 체내 항상성을 유지하는 기능을 하는 중요한 장기인 신장(콩팥)이 불순물을 제대로 걸러주지 못해 체내에 쌓이면서 발생하게 된다. 심할 경우 과염증성물질체내생성(싸이토카인 폭풍)을 동반한 급성 신부전증이 나타나며 혼수․마비 증상까지 이어지기도 한다.

· 해당 질환은 항생제 처리의 임상적 유효성이 없음이 밝혀져 있으며, 특히 HUS는 5~9세 이하의 유아·어린이들에게 집중된 법정감염질환으로써 현재로서는 완치 가능한 치료법이나 저해제등이 개발되어 있지 않아, 주로 혈액투석에 평생의지하거나 장애를 안고 살아가고 있다.

·이뿐만 아니라, HUS유발의 핵심병인자인 장출혈성대장균이 인체 장상피표면으로 분비하는 시가독소는 장점막손상 후 혈액을 통해 신장세뇨관상피표면의 지질수용체(Gb3)에 특이적으로 결합하여 신장내로 침투하여 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다.

· 현재 시가독소를 검출하기 위해 가장 많이 쓰이고 있는 PCR 기반이나 항원-항체 시험법은 숙련된 기술자나 오랜 전처리시간, 그리고 현장에서 고감도로 판별하는데 한계가 있어왔다. 따라서 신속·간편·정확한 시가독소 검출기술개발이 필요한 상황이었다. 바이오기술에 의존적인 키트 이외의 휴대용전자제어기기를 기반으로 한 시가독소검출 고감도센서기술에 관한 연구는 미미한 실정이어서 이 분야에 대한 연구의 필요성이 꾸준히 제기되어 왔다.

· 따라서 이 연구에서, 장출혈성 대장균(EHEC)에서 생성되는 시가독소에 형광표지를 하는 방법을 이용하여, 이를 높은 감도와 정밀도로 형광 강도를 판독할 수 있는 독립형 실시간 광학 검출 장치를 개발하였다.

□ 연구내용

· 연구팀은 용혈성요독증후군(이하 HUS)을 유발하는 장출혈성대장균에서 분비되는 핵심병인자 시가독소의 고감도검출기술을 개발하였다.

· 이 연구에서 연구팀은 휴대용신속간편기기를 기반으로 HUS질환을 유발하는 시가독소가 체내 센서 역할을 하는 특이적인 지질수용체에 결합할 때 신호가 측정되고 수용체가 없을 때는 감지가 안된다는 판별기술을 소개하였다.

· 연구팀에서 고안한 휴대용검출기기의 유리칩표면에 HUS의 원인독성물질인 시가독소가 지질수용체가 표면에 있는 경우에는 형광분자가 달라붙어서 형광빛을 휴대용검출기기가 감지하고 그 결과를 LCD화면에 표시해준다. 하지만 시가독소 특이적 수용체가 없는 세포에서는 형광분자가 달라붙지 않기 때문에 형광 신호검출이 안되고, 검출기기의 LCD화면에서도 결과가 나오지 않게된다.

· 미세한 형광세기를 감지하기 위해 고감도 광전자 증배관(PMT) 부품을 이용하였고, 미약한 신호를 증폭하는 회로를 설계하였다. 또한 작은 패키징 내에서 광학부품을 정확하게 정렬할 수 있도록 3D 프린터를 사용하여 광학 하우징(패키징)을 만들었다. 제작된 시스템은 110 pM의 낮은 형광 감도를 검출할 수 있었고, 2 pg/μl의 낮은 농도의 시가독소 단백질(Stx2B)을 측정할 수 있었다. (다른 고민감도 광학측정시스템은 1 pM이나 150 pM의 감도를 갖지만, 고정밀 측정 기기를 사용해야 하거나, 크기가 본 연구에서 개발된 기기보다 큰 편임)

· 실시간으로 형광 세기를 측정하고 LCD디스플레이에 평균값을 표시하기 위해 소형 마이크로컨트롤러가 사용되었으며, 다른 일반적인 형광검출기와 달리 본 연구팀에서 개발한 휴대용검출기기는 컴퓨터나 추가장치 없이 단독으로 배터리 전원으로 작동하며 시가독소의 양을 표시해준다. 배터리를 제외한 전체 크기는 약 17×13×9 cm³이며 무게는 약 770g으로 들고 다니기에 적당한 크기로 제작되었다.

· 즉, 본 연구의 성과는 현장에서 식품의 시가독소를 쉽고 정확하게 측정할 수 있는 휴대용 식중독 검출기기의 개발의 가능성을 제시하고 있다.

□ 연구성과의 의미

▶ HUS감염질환의 신속 간편 판별기술 : 식중독발생의 현장에서 HUS유발 유무 고감도 신속검출의 원천기술 연구 활용기대

· 종합적으로, 본 연구 결과는 우리 시스템이 휴대성이 좋으면서도, 소량의 시가 독소를 검출할 수 있음을 보여준다. 본 시스템은 현장 식중독 검출 및 형광을 이용한 다른 유형의 생물학적 및 의료 분석에서 다양한 잠재적 응용을 가질 것이며, 소량의 DNA를 검출하도록 설계된 휴대용 PCR 시스템에도 적용될 수 있을 것으로 예상한다.

연구 결과 문답

이번 성과 뭐가 다른가

1. 실시간으로 시가독소를 광학적으로 검출하는 휴대형 검출기기를 개발함

2. 컴퓨터 및 고정밀 측정기기의 도움없이, 자체 시스템만으로 측정이 가능하며, 110 pM의 높은 민감도를 가짐. (다른 고민감도 광학측정시스템은 1 pM이나 150 pM을 갖지만, 고정밀 측정 기기는 크기가 큰 편임)

어디에 쓸 수 있나

1. 현장에서 시가독소를 감지하는 휴대형 검출기기에 적용

2. 광학기반의 생물학적/의료적 샘플 검출기기에 고민감도를 적용하기 위해 활용될 수 있음

실용화까지 필요한 시간은

본 연구에서는 시가독소의 여부를 감지하는 휴대용 광학검출기기 개발로, 측정에 사용된 샘플은 연구실에서 정제된 시가독소나 시가독소와 결합된 세포였다. 실제 현장의 음식물에서 측정용 샘플을 준비하는 시스템이 필요하고 이는 약 3~4년 후면 개발될 수 있을 것으로 예상한다.

실용화를 위한 과제는

시가독소와 결합하는 수용체를 현장 검출용 칩에 고정화하는 기술을 확립하고, 현장에서 식품 샘플을 측정에 맞게 처리해주는 전처리과정을 위한 시스템이 개발되어야 한다.

연구를 시작한 계기는

8년전 토마토 농장에서 박테리아 및 바이러스를 조기에 감지할 수 있는 휴대형 실시간 PCR 기기를 개발하면서, 현장 진단이 가능한 휴대형 기기에 관심이 많아졌다. 작게 만들면서도 정확도와 민감도를 유지하는 것이 쉽지 않았다. Texas A&M University 재학중에 알게 된 두 연구자가 대전에서 다시 만나게 되어 같이 연구할 수 있었다.

꼭 이루고 싶은 목표는

유행성 질병을 현장에서 더 빠르면서도 정확하게 감지할 수 있는 방법을 개발하는 것입니다. (현재 개발된 감지법들은 빠른 것은 민감도가 떨어지고, 민감도가 높은 방법은 속도가 느린 단점이 있음)

신진연구자를 위한 한마디

다양한 분야의 연구자들을 만나보고 서로의 연구에 대해 의견을 나눠보세요. 대전의 대덕연구단지는 우리나라에서 제일 많은 이공계박사들이 모여 있는 곳입니다. 새로운 융합 연구에 대한 아이디어를 많이 얻을 수 있을 것입니다.

용어 설명

1. 용혈성요독증후군(Hemolytic Uremic Syndrome, HUS)

◦ 최근 사회적으로 주목받고 있는 '용혈성요독증후군'(HUS)은 여름철 자주 발생하는 제1군 법정 감염병인 장출혈성대장균감염증(출혈성 장염)의 합병증이다. 1982년 미국 패스트푸드점에서 장출혈성대장균감염증 환자 중 HUS가 처음 집단 발병했을 때 원인이 된 음식이 햄버거여서 '햄버거병'으로 알려졌지만, 이는 정확한 명칭이 아니며 소고기뿐만 아니라 돼지, 양, 닭, 다른 고기와 분변에 오염된 유제품, 채소도 감염원이 될 수 있다. 우리나라 최근 HUS환자의 70%가 6세미만의 영유아임. HUS는 우리 몸의 혈류내 면역세포에 강하게 결합한 상태로 이동한 병원균의 독소 등에 의해 적혈구가 비정상적으로 파괴되면서 손상된 적혈구가 콩팥의 여과 시스템에 찌꺼기처럼 끼어 기능 손상을 초래하며, 미세혈관병증 용혈성 빈혈, 혈소판 감소증, 급성신부전, 중추신경계장애 등이 나타난다.

2. 장출혈성대장균(EHEC)

◦ 보통의 대장균과 다르게 시가독소라고 하는 독성물질을 10개의 변이서열과 함께 오염원에 분비하는 따로 분류된 병원성대장균임.

◦ 주로 가축의 분변으로 오염된 토양이나 그곳에서 수확한 야채, 다진고기, 반추동물의 장내 등이 주요 이 병원균의 병원보유체(reservoir)로 알려져 있음

3. 시가독소(Shiga toxins)

◦ 장출혈성대장균의 오염원에 뿜어내는 독성물질(대장균단백질)

◦ 콩팥에 매우 특이적인 지질수용체가 표면에 발현하고 있어 시가독소가 콩팥에 강하게 결합가능

4. 광전자 증배관 (Photomultiplier tube, PMT)

◦ 현존하는 광센서 중에서 감도가 가장 높은 센서로 고정밀 광측정 실험이나 야간 투시경 등에 사용

◦ 광입자가 입사되면 이를 전자로 방출한 후, 전자 수를 증폭하여 전기적인 신호로 출력함.

5. 마이크로컨트롤러 (Microcontroller, MCU)

◦ 마이크로프로세서, 메모리, 입출력 모듈이 하나의 칩으로 제작되어 정해진 기능을 수행하는 컴퓨터 유닛.

◦ 현재는 다양한 기능을 제공하는 거의 모든 가전제품 내에 장착되고 있음 (임베디드 시스템)